1、大黄总蒽醌的纯化工艺研究 摘要：目的：确定DM301型大孔树脂对大黄总蒽醌类成分纯化工艺的参数。方法：以大黄中总蒽醌的含量为指标，研究DM301型大孔树脂的富集、纯化大黄总蒽醌的吸附性能和洗脱参数。结果：DM301型大孔树脂对大黄总蒽醌有良好的吸附性能。以10g大孔吸附树脂为标准量，最佳纯化工艺为药液浓度0.4g生药材/mL，pH=6，最大上样量为15-20mL，洗脱剂为90%乙醇，流速为2mL/min，用90%乙醇80mL洗脱时可以达到良好的除杂效果。结论：通过DM301大孔吸附树脂富集、纯化后，大黄总蒽醌的吸附率在70%以上，洗脱率在80%以上。说明采用本法富集、纯化大黄总蒽醌是可行的。关
2、键词：DM301型大孔吸附树脂；大黄总蒽醌；纯化工艺Study on Purification Process of Total Anthraquinones in Radix et Rhizoma Rhei Abstract：Objective：To establish the technological parameters of the purifrication process of total anthraquinones in Radix et Riftzoma Rhei with DM301 Maeroreticular Resin. Methods：The adsorptive
3、 characteristies and elutive parameters of the process were studied by taking the content of total anthraquinones as marker. Results：DM301 Maeroretieular Resin has good purification process. The appropriate adsorption condition of DM301 Maeroretieular Resin was as follows：Concentration of chemical i
4、s 0.4g/mL，pH 6. Its static exchange capacity was 15-20mL. then was washed with 80mL 90alcohol for macroreticular resin，flow rate of 2mL/min.Conclusion：With DM301 Macroreticular Resin to adsorb and purify，the elufive ratio of total anthraquinones in Radix et Rhizoma Rhei was over 80 and the adsorptio
5、n reached over 70So this process of applying macroretieular resin to adsorb and purify total anthraqulnones in Radix et Rhizoma Rhei is feasible.Keywords：DM301 macroporous resin；total anthraquinone；purification目 录摘要III1 前言12 材料与仪器32.1 材料32.2 仪器33 方法与结果43.1 大黄提取液的制备43.2 供试品溶液的制备43.3 对照品溶液的制备43.4 大黄总蒽
6、醌含量的测定43.5 方法学考察43.6 DM301大孔树脂的吸附和解吸附特性73.7 验证实验134 讨论14参考文献16综述18致谢271 前言大黄属蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎，性寒味苦，是临床常用中药之一。大黄具有泻下、抗菌、抗病毒、抗肿瘤、消炎等功效1，近期研究发现大黄具有保护大脑皮层神经元的作用2，对治疗肝性脑病疗效显著3。大黄中化学成分复杂，有蒽苷、芪苷、鞣苷等，其中蒽苷为最主要成分。大黄中羟基蒽醌衍生物总量约为25
7、，分为游离蒽醌和结合蒽醌，包括大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素及其苷等4。 传统分离提取大黄总蒽醌有明胶沉淀法、醇调pH值法、聚酰胺法等，大黄提取的传统方法存在着有效成分损失大，周期长，工序多，提取率低等问题。近年来，大孔吸附树脂在中药的提取、分离、富集方面广泛运用，不断受到药学研究者的关注。 大孔树脂是20世纪60年代发展起来的一种新型吸附剂，既有物理吸附作用，又因多孔状结构而有筛选作用5，在中药有效成分分离提取的应用中，呈现出良好的发展势头。大孔树脂吸附纯化中药的有效成分效果受PH、上样量、洗脱剂等多方面因素的影响，因此大孔树脂在纯化有效成分必须寻找最佳的工艺参数。DM301
8、型树脂是一种中等极性的树脂，在分离黄酮类、生物碱、蒽醌类等成分有较为明显的分离效果。DM301型树脂用于大黄中总蒽醌类物质的纯化与其工艺参数的研究却尚未见报道。本实验通过对提取液pH、提取液浓度、最大上样量、洗脱液浓度、洗脱流速、洗脱用量等方面的考察筛选出适合分离纯化大黄总蒽醌的静态和动态吸附工艺，从而为日后制备成各类剂型提供实验依据。大黄是一种多年生草本植物。我国有大黄45个品种和两个亚种，但载入药典可以药用的只有3种，即正品大黄、唐古特大黄及药用大黄的干燥根及根茎。神农本草经中记述：大黄，味苦寒，归胃、肝大肠经。主下淤血、血闭寒热、破症、积聚、留饮宿食、荡涤肠胃、推陈致新、通利水谷、调中化
9、食、安合五脏。目前对大黄有效成分的药理作用研究主要集中在蒽醌类化合物。20世纪80年代以来，国内外对中药大黄，尤其是其有效成分的药理作用进行了深入研究。大黄具有泻下作用，主要作用成分为蒽醌类化合物，其中以番泄苷的作用最强，周氏等6认为番泄苷水解后生成大黄酸蒽酮而起泻下作用；大黄对多种细菌均有不同程度的抑制作用，钱氏7用大黄醇提片治疗急性肠炎54例、急性细菌性痢疾110例，总效率95%；大黄还可治疗慢性肾衰，研究发现，大黄能改善氮质血症，影响残余肾组织代偿性肥大，降低残余肾的高代谢状态，纠正脂代谢紊乱，减少蛋白尿，抑制肾小球系膜细胞的增值8；有研究表明大黄的不同成分对细胞内游离钙水平的影响不同，
10、直接提示了大黄对肝细胞的功能具有多种调节作用9；大黄能使损伤局部的血管收缩，血管通透性降低，从而使出血时间缩短10，达到止血的效果；大黄具有清热下火的作用，其作用机理为：大黄可以降低感染家兔第三脑室灌流液中PGE含量，影响中枢环核苷酸的水平，从而达到降温作用11，夏氏12应用大黄治疗l7例急性胰腺炎高热患者，均于3-7d体温恢复正常；倪氏等13利用实验得到大黄酸可显著抑制巨噬细胞内白三烯B4、白三烯C4的生物合成，因此认为大黄酸显著影响巨噬细胞脂类炎性介质活化过程，可能是大黄的抗炎作用机制之一；此外，大黄还具有抗肿瘤作用，主要通过抑制肿瘤细胞的增生、促进细胞凋亡，抑制细胞色素P450(CYP1
11、A1)和抗突变作用，以及抑制N-乙酰转移酶的活性实现的14；大黄素可促进TNF-A的分泌，且大黄素也能抑制炎症反应中的NO的大量合成和释放，提示大黄素对机体的免疫功能，可能具有双向调节作用15。传统的纯化大黄总蒽醌方法有明胶沉淀法16、醇调pH值法17、聚酰胺法18，这三种方法主要用来除去大黄中的鞣质，但是不能达到很好的分离、富集作用。近年来利用大孔树脂对大黄蒽醌类成分进行纯化富集可达到良好的效果。大孔树脂是20世纪60年代发展起来的一种新型吸附剂，既有物理吸附作用，又因多孔状结构而有筛选作用。在中药有效成分分离提取的应用中，呈现出良好的发展势头19。袁倚盛等20用大孔树脂吸附法，使总蒽醌的含
12、量达到50以上，收率较高。金波等21以大黄总蒽醌的提取率及洗脱率为考察指标，考察大黄的提取条件及大孔吸附树脂富集、纯化大黄总蒽醌的吸附性能和洗脱参数。通过大孔吸附树脂富集与纯化，用70%乙醇洗脱，总蒽醌的洗脱收率在80以上。许汉林等22比较了D301、AB-8、X-5、NKA-2、H1020型号的5种大孔树脂对大黄总蒽醌的吸附性能；以大黄总蒽醌中的代表成分大黄素为考察指标，结果D301树脂对大黄总蒽醌的吸附性能最佳。黄园等23在研究大黄总蒽醌纯化工艺时，采用了4种方法(明胶沉淀法、醇调pH值法、聚酰胺法以及大孔吸附树脂法)对大黄提取液富集效果进行研究，结果表明大孔树脂对大黄总蒽醌的富集效果最好
13、。王高森等24以一个含有生物碱、蒽醌、皂苷等由黄连、大黄、知母等药材组成的中药复方为样品，采用4种型号(LD605，F95-34，F95-36，F95-37型)大孔树脂进行吸附纯化工艺和特性研究。结果表明，上柱药液与上柱体积比以LD605型最高，可达10：1，其余3种树脂体积比仅为LD605型的80-90。对比4种树脂的比上柱量以可溶性浸出物计，以大黄总蒽醌计，LD605型树脂最高。刘峰群等25以D101型大孔吸附树脂分离大黄中结合型蒽醌提取物，加样吸附1h，以足够量水冲洗吸附柱，流速约lmL/min，至洗脱液几乎无色，改用50的乙醇液冲洗，采用比色法考察总提取物中结合型蒽醌类物质的含量，总收
14、率87.6。2 材料与仪器2.1 材料大黄饮片（致信药业有限公司，经广州中医药大学中药鉴定教研室李薇教授鉴定）；1，8-二羟基蒽醌对照品（中国药品生物制品检定所，批号0829-9702）；DM301大孔树脂（天津市海光化工有限公司），氯仿、甲醇、硫酸、氢氧化钠、95%乙醇均购自天津富宇化学试剂厂，均为分析纯。2.2 仪器紫外-可见分光光度计(Spectronic GenesysTM2)；旋转蒸发仪RE-2000（上海亚荣生化仪器厂）；TC15套式恒温器（海宁市新华医疗器械厂）；远红外辐射干燥箱（南通科学仪器厂）；三角牌电炉（中华人民共和国制造）；HHS数显恒温水浴锅；LIBROR AEG-22
15、0（日本岛津：0.1mg）、BP211D（德国赛多利斯：0.01mg）；超声仪CQ200（上海音波声电科技公司）；旋转蒸发仪RE-2000（上海亚荣生化仪器厂）；低温循环水真空泵 DLS2-（巩义予华仪器有限责任公司）3 方法与结果3.1 大黄提取液的制备取过10目筛大黄药材粉末约40g，称定，加入12倍量的60%乙醇，加热回流提取3次，每次30min，滤过，滤液减压浓缩至无乙醇味，转移至100mL量瓶中，加水稀释至刻度，制成0.4g(相当于原药材)/mL的大黄提取液。3.2 供试品溶液的制备精密移取大黄提取液10mL于100mL圆底烧瓶中，加2.5mol/L硫酸溶液10mL和氯仿10mL，水浴加热回流水解1h，放冷至室温，将溶液移至分液漏斗，回收氯仿层，酸水层用氯仿洗至氯仿层不显黄色，合并氯仿液，用水洗氯仿液至中性，氯仿液转移至250mL圆底烧瓶中，减压回收至干，残渣用0.5%醋酸镁-甲醇溶液溶解并定容至10mL，滤过，取续滤液1mL置10mL容量瓶中，用0.5%醋酸镁-甲醇溶液稀释至刻度，即得。3.3 对照品溶液的制备精密称取1，8-二羟基蒽醌对照品10.48mg，用氯仿溶解并定容为100mL的对照品溶液。3.4 大黄总蒽醌含量的测定以0.5%醋酸镁-甲醇溶液作为空白对照
