1、化橘红提取物中总黄酮测定方法比较研究 摘要：目的 对比3种常见总黄酮测定方法（国家食品药品监督管理局颁布的保健食品检验与评价技术规范实施手册收载的保健食品总黄酮测定方法(直接紫外分光光度法测定)；2010版中国药典收录的铝盐络合法；国际公认的较为科学合理的是美国康奈尔大学刘瑞海教授的Sodium Borohydride/Chloranil-Based Assay (简称 SBC 法)。方法 以化橘红中总黄酮的含量为指标，从精密度、回收率、重复性、稳定性方面选取最优测定方案。结果 测定结果显示铝盐络合法测得值显著大于保健食品法和SBC法测得值。结论 化橘红黄酮类成分主要为二氢黄酮成分，在碱性条件
2、下不稳定，因此不宜应用在碱性条件下操作的芦丁比色法，应用铝盐直接与黄酮类成分显色的原理，采用柚皮苷+铝盐的方法进行总黄酮测定。测定结果显示铝盐络合法测得值显著大于紫外分光光度法和SBC法测得值。关键词：化橘红；黄酮；测定方法Study on TotalflavonoidsinExocarpium citri Grandisextractcomparative methodAbstract：Objective Comparison of 3 methods for the determination of total flavonoids(commonmethod usedmanual heal
3、th foodof total flavonoids of implementing technical standards for testing and assessment ofhealth food was promugated by the State Food and Drug Administration(bydirect ultraviolet spectrophotometry);2010 EditionPharmacopoeia included Chinesealuminum saltcomplexing;internationally recognizedmore sc
4、ientific and reasonableis a professor at theCornell UniversityLiu RuihaiSodiumBorohydrid/Chloranil-BasedAssay America(SBC).Select the bestfrom theprecision, recovery rate,stability and other aspects ofmeasurement. Methods The contentoftotal flavonoidsinorangeas theindicator,theprecision,recovery, re
5、peatability,stabilitydetermination ofoptimal selection ofschemes.Results The results showedthe aluminum saltcomplexingmeasured valuewas significantly higher than that ofhealth foodand SBCmeasured value.Conclusion Flavonois withpolyamide column chromatographyare selectively enrichedcontaining phenoli
6、c hydroxylradicalsby UV spectrophotometry,withoutcolordetermination, the resultis accurate and simple,reasonabledeterminationmethod.Keywords：Exocarpium citri Grandis，Flavone，assay methodI目 录摘要III1 前言32 材料与仪器52.1材料52.2仪器53 方法与结果53.1紫外分光光度法53.2铝盐络合法73.3 SBC法93.4 总黄酮含量测定114 讨论124.1紫外分光光度法机理124.2 铝盐络合法机
7、理124.3 SBC法反应机理124.4测定方法的比较12参考文献14综述15致谢221 前言目前，国际上对中药的利用和研究产生了浓厚的兴趣，传统中药越来越受到人们的青睐，具有很高的利用价值和潜在的市场前景。化橘红是我国特有的传统中药材，古代记载和现代研究表明化橘红内含多种活性成分，具有化痰、理气、健脾、消食、散寒等作用，始于胸中痰滞，风寒咳嗽，喉痒气喘，饮食积滞，呕吐痞闷等症。化橘红黄酮类化合物是目前研究的热点之一。中药化橘红( Exocarpium citri Grandis)又名“化州橘红”、“化州陈皮”、“柚皮橘红”等，是由芸香科(Rutaceae)植物化州柚(Citrus grand
8、is(L.)Osbeck var.tomentosa Hort.)或柚(Citrus grandis(L)Osbeck)未成熟或近成熟的果实外果皮干燥而成。化州柚原产于广东省化州市，果实比较小，果瓤酸苦。人们将未成熟果皮制得的化橘红称为“毛橘红”，近成熟的称为“光橘红”，两者均有助于消食、利气、散寒、化疲，主治风寒咳嗽、痰多气逆、食积暖气和呕恶痞闷等证1。为了探究化橘红的功能性质，对其化学成分进行研究发现：化橘红主要有效成分有黄酮类化合物、挥发油、香豆素类化合物、多糖等2。近年来，国际上掀起了新一轮的中医药热。自古以来，中药一直在中华民族的防病治病方面具有举足轻重的作用，即便是在今天，医学技术
9、飞速发展，中药在人们的日常防治疾病中仍然扮演着重要角色。传统中医药被誉为“天然药物”、“绿色药物”等，逐渐成为世人青睐的对象。我国地大物博，中药材资源非常丰富，主要来源于自然界，分布广泛，品种繁多。当品种、产地、采集时间、加工方法等因素中的一项或几项不同时，中药材的质量也各不相同，而临床疗效与中药材质量密不可分。同时，中医药发展的国际环境也发生了深刻的变化。自古以来，化橘红就有着“南方人参”、“一片值一金”之称，被誉为“中华一宝”。它曾获得世界华人协会推荐产品、21世纪国际健康绿色环保产品“金象金奖”、2001年度国际农业博览会推荐名优产品等荣誉。本文主要针对化橘红黄酮类化合物的测定方法进行深
10、入研究。黄酮类化合物是一类重要的天然有机化合物，是植物在长期自然选择过程中产生的一类次生代谢产物3。它广泛存在于高等植物及羊齿植物的根、茎、叶、花、果实等中4，不仅数量种类繁多，而且结构类型复杂多样。黄酮类化合物因其独特的化学结构而对哺乳动物和其它类型的细胞具有许多重要的生理、生化作用。一方面，黄酮类化合物具有高度的化学反应性，例如，它能清除生物体内的自由基，具有抗氧化作用56；另一方面，黄酮类化合物又具有很多重要的药理作用，对许多人类疾病具有治疗价值。它们拥有抑制酶的活性、抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎症、抗过敏、抗糖尿病并发症等功能，且无毒无害，对人类的肿瘤、衰老、心血管病等退变性疾病的治疗和预
11、防有重要意义，它作为弱雌激素，在治疗妇女更年期综合症方面有很好的应用前景。此外，黄酮类化合物还是茶及众多中草药如黄芩、银杏、沙棘等的活性成分。因此，引起了国内外化学家、药物学家的广泛重视，研究进展很快。黄酮类化合物是广泛存在于自然界的、泛指两个苯环通过三个碳原子相互联结而成的一系列化合物，包括黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、查尔酮、异黄酮类等化合物。很多黄酮类化合物具有生理活性，例如芦丁、槲皮素等能够增强心脏收缩, 减少心脏搏动数；杜鹃素具有止咳祛痰作用；黄芩苷具有抗菌消炎作用；汉黄芩素具有抑制肿瘤细胞作用；水飞蓟素具有保肝作用等7。黄酮类化合物具有C6-C3-C6基本骨架，并且大都呈黄色
12、，其生色团的基本结构是吡酮环和羰基，黄酮物质的呈色是由羟基的数目，结合的位置与交叉共扼体系共同决定的。黄酮、黄酮醇多呈灰黄到黄色；查耳酮为黄至橙黄色，二氢黄酮、二氢黄酮醇、异黄酮类，不呈黄色，几乎为无色；花色素所显的颜色，随pH不同而改变。黄酮类化合物因大部分含有酚羟基，显酸性，易溶于碱性溶液；其分子中-吡喃酮环上的1-氧原子，因有未共用电子对，故表现出微弱的碱性，可与强酸溶液反应。目前关于总黄酮的测定方法报导较多，收载入相关国家标准的有2种方法，国家食品药品监督管理局颁布的保健食品检验与评价技术规范实施手册收载的保健食品总黄酮测定方法(采用的是直接紫外测定法)；2010版中国药典收录的“铝盐
13、络合法”8。另外，国际公认的较为科学合理的是美国康奈尔大学刘瑞海教授的Sodium Borohydride/Chloranil-Based Assay（简称SBC法）9。此三法的准确性、合理性比较研究尚未见报道。本试验以化橘红提取物为研究对象，以其总黄酮含量为评价指标，比较了上述3种方法对其含量测定的影响，为化橘红中总黄酮最佳测定方法的优选提供依据。2 材料与仪器2.1材料聚酞胺粉(柱层析用，60-80目，浙江台州市路桥四甲生化塑料厂)；水为怡宝水；盐酸(广州化学试剂厂，批号20100605)、冰乙酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，20110603)、丙酮、甲醇(广东光华科技股份有限公司，批号
14、20111126)，硝酸铝(天津市科密欧化学试剂有限公司，20100710)、四氢硼钠NaBH4(天津市北联精细化学品开发有限公司，20110420)、氯醌chloranil ( Aladdin Chemistry，批号30560)、香草醛vanillin(天津市大茂化学试剂厂)、四氢呋喃THF(天津市富宇精细化工有限公司，20100705)，氯化铝(汕头市光华试剂厂，批号20040108)，柚皮苷对照品(北京世纪奥科生物技术有限公司，HPLC98%,20mg/支)，化橘红总黄酮提取物样品。2.2仪器8453E型紫外可见分光光度计(美国Agilent )，BP211-D型电子天平(德国S ar
15、torius公司)，KQ-500型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，XT220A万分之一天平( Precisa公司)，HH-S6数显恒温水浴锅(常州普天仪器制造有限公司)，Rayto酶标仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)。3 方法与结果3.1紫外分光光度法3.1.1 芦丁对照品制备精密称取经105干燥至恒重的芦丁标准品5.0mg，加甲醇溶解并定容至100mL，即得0.050mg/mL芦丁标准溶液。3.1.2 样品溶液的制备取供试品0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25mL，超声提取20min，静置，备用。3.1.3 标准曲线的绘制吸取芦丁标准溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于lOmL比色管中,加甲醇至刻度，摇匀，于波长360nm比色。以对照品溶液浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得直线回归方程为y = 0.0271x - 0.0352（R=0.9993，线性范围为0.0049-0.0251mg/mL）。3.1.4 精密度试验取芦丁供试品溶液(0.01483mg/mL)，连续测定5次，结果其吸光度均值为0.3667，RSD为0.0007%，表明精密度良好。3.1.5
