1、复方葛根桂枝汤中葛根素在大鼠体内的药动学研究摘要：目的 建立HPLC-MS快速测定大鼠血清中葛根素浓度的方法,通过比较葛根素及复方葛根桂枝汤中葛根素的药动学特点，评价复方中其他配伍对葛根素药动学的影响。方法 将大鼠分为葛根素组和复方葛根桂枝汤组，分别于不同时间点采血，用高效液相色谱-质谱串联法测定血浆中葛根素的浓度，采用DAS 2.0软件计算药动学参数。结果 大鼠灌胃给予复方葛根桂枝汤和葛根素后的主要药动学参数：AUC(0-t) 分别为15.10.9 ug/L*h 和 139225.2 ug/L*h，MRT(0-)分别为8.73.8 h 和5.20.12 h，t1/2 分别为 6.53.8 h
2、 和3.40.6 h，Tmax分别为1.00 h和 1.61.5 h，葛根素与复方桂枝葛根汤的主要药动学参数具有显著性差异。结论 复方桂枝葛根汤中复杂成分的存在能影响其有效成分葛根素的体内药动学特点。关键词：葛根素；复方葛根桂枝汤；药动学；液质联用Study on Pharmacokineics of Puerarin in Fufanggegenguizhi Decoction in RatsAbstract:Objective To establish a rapid HPLC-MS method for the determination, to compare pharmacokine
3、ics of puerarin and Fufangguizhigegen Decoction in rats and to assess the effect of other components in compound on the pharmaeokineties of puerarin. Methods Rats were divided into puerarin and Fufanggegenguizhi Decoction extract group, blood at different time points. The plasma concentration of the
4、 puerarin and Fufangguizhigegen Decoction was analyzed by HPLC-MS. The pharmacokinetics parameters were calculated with DAS 2.0. Results The pharmacokinetic parameters Fufanggegenguizhi Decoction extract and puerarian were as follows AUC(0-t)15.10.9 ug/L*h and 139225.2 ug/L*h，MRT(0-) 8.73.8 h and 5.
5、20.12 h，t1/2 6.53.8 h and 3.40.6 h，Tmax 1.00 h and 1.61.5 h .These parameters have significant difference. Conclusion The complex components in Fufangguizhigegen Decoction can affect the pharmacokinetics of puerarin in rat in vivo. Key words: puerarin，Fufanggegenguizhi Decoction，pharmacokinetic， HPL
6、C-MSI目 录 摘要I-II1 前言12 材料与仪器 22.1 材料22.2实验动物22.3仪器23 方法23.1药品制备23.2动物分组与处理33.3 高效液相色谱-质谱串联法的色谱与质谱条件33.4 药动学数据处理44 结果44.1 hplc-ms的方法学考察54.2 复方桂枝葛根汤的药代动力学研究65 讨论95.1 测量指标的选择95.2血浆样品的处理95.3检测条件105.4 研究结果差异性探讨105.5研究展望11参考文献12综述14致谢191 前言复方桂枝葛根汤处方源于某中医院的经验方，是由张仲景的经典方剂桂枝加葛根汤加减变化而成，由葛根、桂枝、白芍、细辛、羌活等10味中药组成，
7、具有祛风除湿，通痹止痛的作用，临床上用于治疗风寒湿阻型颈椎病。方中葛根为君药，乃发张仲景葛根汤善治“项背强几几”之意，重用葛根升阳解肌，疏利关节，并引药上行达病所，对改善头痛、眩晕、项强、肢体麻木等症状有效1；对该复方的研究多是临床病例，临床实践的分析，及临床作用机制的研究。张敏2通过对桂枝加葛根汤用于治疗颈椎病的疗效观察发现，患者治疗两周后，症状均有不同程度的改善，总有效率达到了92%。刘梅3等研究发现葛根桂枝汤能上调椎间盘组织Fas表达，下调bcl-2表达，从而发挥延缓椎间盘退变的作用。目前关于该复方的研究多是从整体出发，本实验研究试图通过对单味药的药动学变化研究，来为该复方的配伍合理性，
8、提供依据。葛根素(Puerarin)作为本实验的研究对象，它是从葛根中提取的主要有效成分，具有扩张心脑血管、降低心肌耗氧以及抗肿瘤、抗氧化的作用，临床上主要用于治疗心血管疾病4-5。复方葛根桂枝汤中，作为研究对象的君药葛根有效成分为葛根素。近年来随着药动学研究的兴起，对于单味药尤其的药动学分析研究较多，有学者用HPLC法测定葛根素在大鼠体内的药动学过程结果表明，大鼠灌胃葛根素后的药-时过程符合二室模型6-7。而关于葛根素药动学研究概况如下：葛根素吸收较快，但胃肠道吸收程度较差，口服生物利用度较低，大部分经粪便以原型排泄，仅有少部分吸收人血，分布到各组织器官，在肝脏经细胞色素P450代谢8-9。
9、中药成分复杂，在体内过程尚未阐明，疗效与药效的物质基础及中药制剂用量的三者数量关系不明确，因此对于中药制剂的临床使用，尚存在剂量的安全隐患。对中药制剂进行药动学研究，阐明药效发挥的基础，建立符合中医自身规律的用药原则，为中药制剂安全、合理、有效地用药治疗疾病提供可靠而坚定的基础。在此基础上，我们对复方桂枝葛根汤进行药代动力学研究，而方中的君药葛根主要有效成分为葛根素，故我们选取这该指标对复方桂枝葛根汤进行药代动力学研究。通过比较葛根素在大鼠体内药动学参数，阐明葛根素在大鼠体内吸收分布过程，为临床合理用药提供理论依据。2 材料与仪器 2.1 材料葛根素由中国食品药品检定研究院提供，规格20mg/
10、每瓶，批号：HDGGS01。甲醇、乙腈，甲酸为色谱纯，由MERCK公司提供。处方中所用的十味药材均购于广东致信药业有限公司。其他试剂均为市售分析纯。实验用水为超纯水。2.2实验动物SD大鼠雌雄各半,体重范围：180-220g，来源：广州中医药大学实验动物中心，等级：SPF级，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2013-0217。2.3仪器TC-15套式恒温器（浙江新华医疗器械厂）；东方-A型电热恒温干燥器（广州东方电热干燥设备厂）；HH-S4数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂）；BS224S型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司 d=0.0001）；JJ200型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂
11、）；GL-20G-型高速冷冻离心机（上海Anke公司）。液相-质谱联用分析系统（LC-MS/MS），包括资生堂公司VP系列Nanospace S1-2 3301二元泵和Nanospace S1-2 3202在线脱气机（日本），Nanospace S1-2 3133多用途自动进样器以及AB公司API-4000 Q-Trap质谱检测器（含ESI离子源），色谱柱：Thermo Syncronis-C18 (2.150 mm, 5 m)。3 方法3.1药品制备3.1.1 复方浓缩物的制备及葛根素对照品灌胃液的制备取葛根30g川芎10g桂枝10g白止10g白芍15g防风10g细辛3g威灵仙15g羌活10
12、g炙甘草10g的比例配方，共246g。按比例加入8倍量的水，加热回流提取12小时，浓缩药液至1g/ml浓度，待用。精密称取葛根素100mg，用含有0.3%吐温和5%乙醇的水溶液，定容至10ml容量瓶中，配制为10mg/ml葛根素溶液，用于大鼠给药。3.1.2 葛根素工作液及内标标准溶液的配制葛根素工作液的配制：精密称取葛根素2.23mg，置于 1ml容量瓶中，加入甲醇定容至1ml，充分震荡摇匀，得2.23mg/ml的葛根素储备液，后经一系列稀释成100g/ml，10g/ml，5g/ml,1g/ml,0.25g/ml,50ng/ml，10ng/ml,5ng/ml，2.5ng/ml浓度的工作液，置
13、于4下保存备用。内标标准溶液的配制：精密称取对羟基苯甲酸甲酯1.96mg，置于1 ml容量瓶中，加入甲醇定容至1ml，充分震荡摇匀，得1.96mg/ml的内标储备液。后稀释成100ng/mL的内标标准溶液，置于4下保存备用。3.2动物分组与处理3.2.1动物分组将大鼠分2组，每组8只，雌雄各半。第一组葛根素组；第二组复方桂枝葛根汤组。给药前禁食12 h，饮水自由。葛根素组大鼠按30 mg/kg的剂量口服给予葛根素，复方桂枝葛根汤组按5 g/kg的剂量给予复方桂枝葛根汤。葛根素组在给药前及给药后0.083，0.33，0.83，1.3，2，4，6，8，10，16h, 24h时间点采血，复方桂枝葛根
14、汤组在给药前及给药后0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，4，6，8，12h时间点采血,经眼眶后静脉丛采全血约0.5 mL，置肝素化试管中，6000 rpm离心10 min，分离血浆，-80保存待测。3.2.2 血浆样品预处理采用蛋白沉淀法进行样品前处理，取100 L 血浆，加入10 uL甲醇：水(1:1)溶液，混合，加入 300 L含100ng/mL对羟基苯甲酸甲酯溶液的甲醇溶液后，充分振荡混匀，于14000 g、4离心10 min，取上清液进行分析。3.3 高效液相色谱-质谱串联法的色谱与质谱条件流动相A为水相，5% 乙腈（包含0.1% FA）；流动相B为有机相，95%乙腈（包含0.1% FA）。流速为0.2 mLmin-1，柱温：室温，
