1、正交设计法优选石榴皮中总多酚的提取工艺研究 摘要：目的 对石榴皮中总多酚的提取工艺进行研究，并运用正交设计法对其提取工艺进行优选，以获得最佳的提取工艺。方法 以没食子酸为对照，选取磷钼钨酸法对其显色，用紫外分光光度法在760nm处测定总多酚的吸光度，再根据标准曲线法计算石榴皮中总多酚的含量。采用L9（34）正交实验设计，以石榴皮中总多酚含量为考察指标，考察乙醇浓度、提取时间、乙醇用量、提取温度4个因素对总多酚提取的影响。结果 最佳的提取工艺为固定超声波功率100W，乙醇浓度为30%，提取温度为60，料液比为1:30（gmL-1），提取时间为40min。结论 该工艺经试验含量测定方法简便、准确、
2、重复性好，提取工艺经济、合理，值得进一步推广，对进一步的工艺开发有较好的参考价值。 关键词：石榴皮；总多酚；紫外可见分光光度法；正交设计法Study on the Extraction Process by Orthogonal Design of Total Polyphenols in Pomegranate PeelAbstract: Objective Study on the extractive process of polyphenols quantities and using the orthogonal experimental design method to selec
3、t the best one. Methods Used gallic acid as a control matter selected the phosphomolybdic tungstic acid to carry out its color determined the absorbance at 760nm of polyphenols by using the ultraviolet spectrophotometry then calculated the total quantities of polyphenols according to standard curve
4、method. By using the L9(34) orthogonal experimental design,method to carry out the experiment and the total polyphenols in the pomegranate peel as a factor observing the ethanol concentration,extractive time,ratio of raw material to solvent and extractive temperature.Results The optimum extraction c
5、ondition was as follows ultrasonic power of 100W,30% ethanol,extraction temperature of 60,ratio of raw material to solvent of 1:30(gmL-1),extraction time of 40 minutes. Conclutions The content determination method is simple,accurate and reproducible.Extraction which is technology,reasonable and econ
6、omy worths of further promotion and to the further development,it has good reference value.Keywords:pomegranate peel;total polyphenols;ultraviolet spectrophotometry; method orthogonal experimental designI目 录摘要-1 前言12 材料与仪器32.1试剂与试药32.2主要仪器33 方法43.1 石榴皮总多酚含量测定方法43.2 方法学考察53.3 石榴皮中总多酚的提取工艺优化64 结果74.1
7、石榴皮总多酚含量测定方法74.2 方法学考察结果74.3 石榴皮中总多酚的乙醇提取工艺优化结果105 讨论145.1 提取条件分析145.2 石榴皮总多酚的显色条件分析155.3 最大吸收波长选择165.4 正交试验结果分析165.5 其他166 结论17参考文献18综述20致谢321 前言石榴皮(Punicagmnate Peel)系石榴科（Punicaceae）石榴属（Punica L.）植物石榴（Punica granatum L.）的干燥果皮，秋季果实成熟，果皮开裂时采摘，去除种子及隔瓤，晒干或微火烘干。石榴皮是包裹在石榴果实外层的外皮，占石榴的20%30%，大小不一，厚1.53mm，
8、为不规则的片状或瓢状。外表面红棕色、棕黄色或暗棕色，略有光泽，粗糙，有多数疣状突起，有的有突起的筒状宿萼及粗短果梗或果梗痕。内表面红棕色或黄色，有隆起呈网状的果蒂残痕。质硬而脆，断面黄色，略显颗粒状。作为传统中药，在中国药典（2010年版）第一部记载：“性酸、温、涩；具有涩肠止泻、止血、驱虫等作用。用于久泻、久痢、便血、脱肛、崩漏、白带、虫积腹痛”。石榴，别名安石榴、榭榴、丹若、金庞、海榴、甘石榴、天浆、若榴等，原产于伊朗及阿富汗等中亚地区，现在主要分布在亚热带及温带地区。据史书博物志记载：“汉张骞出使西域，得涂林安石榴种以归，名为安石榴”。在中国至今已有2000多年栽培历史，常被人们誉为“天
9、下奇果，九州名果”。石榴果皮和根皮可入药，且是印染和制革工业的原料。我国目前已形成了河南荥阳和开封、陕西临潼、山东枣庄、安徽怀远、四川会理、云南蒙自和新疆叶城8大石榴主产区，栽植面积达64668hm2，居世界首位，产量达38万多吨1。随着石榴越来越受到人们的喜爱，石榴已经成为我国重点发展的水果之一，国内外学者对石榴皮的研究也越来越多。有文献报道2，1929年，Emanuele Flaccomio分析了新鲜石榴果皮的成分，石榴皮含鞣花单宁10.421.3%，蜡0.8%，树脂4.5%，甘露醇1.8%，糖2.7%，树胶3.2%，没食子酸4%等。1963年，SRajadurai等3人又从石榴皮中分析出
10、异斛皮甙和石榴皮碱。1995年，云南省农科院生物技术研究所4对蒙自石榴皮的氨基酸组分进行了分析，石榴皮含有多种氨基酸。另外，一系列的实验研究表明石榴皮有凝集精液和体内抗免生育的作用，对生殖器疱疹病毒、淋球菌和白色念珠菌有明显的抑制和杀灭作用，而且没有副作用5。因此，石榴皮在避孕、控制和治疗性传播疾病方面很有发展前景6。Saito等7从日本上千种药用植物中筛选具有抗氧化能力的可食用植物，结果表明石榴皮提取物列第一，检测表明其抗氧化活性与多酚含量相关。石榴中多酚物质主要分布于石榴皮中，约为10.4%21.3%8。石榴皮多酚是一类具有多酚羟基化合物的总称，主要包括鞣质类（水解鞣质）和黄酮类化合物（黄
11、酮醇、黄烷醇、花色苷）等。石榴皮其他的化学成分有甾体类和三萜类、甘油三酯、有机酸和酚酸、脂肪酸和生物碱类。石榴皮多酚作为石榴皮中一种重要的生理活性成分，具有抗氧化、抗菌、抗突变、抗癌和降血脂等生物学功效，在食品、医药和化妆品等领域有巨大的应用价值9-11。石榴皮多酚提取方法各异，有直接煎熬提取法，微波提取法，超声波提取法，超临界流体萃取法等，王玲等12探讨了石榴皮多酚的最佳超声提取工艺条件为：目数为6080目，提取功率为385W。料液比1:25，提取时间120s，提取三次，多酚得率高达21.4%。郭晓萍等13采用煎熬法提取石榴皮鞣质的工艺为：抽提比1:40，温度90，时间40min，鞣质的含量
12、为17.3%。姜萍等14采用超临界CO2萃取，得到萃取条件为：温度44，压力25Mpa，乙酸乙酯为夹带剂，萃取时间120min，得率能到57. 83%。石榴皮总多酚的测定一般是采用分光光度计法，张茜等15采用的Folin-酚法对石榴皮提取物中多酚的含量进行测定，以没食子酸的量为对照品。近年来，随着人们对石榴皮营养保健价值的认识，石榴皮的研究成为热点。我国的石榴资源十分丰富，种植面积不断扩大，石榴的综合利用尚有很大的空间，而石榴皮除部分药用外几乎都被丢弃，这造成很大的资源浪费。目前，国内外对石榴皮的研究均主要集中在有效成分的抗氧化作用及其产生的药理活性、药效及作用机制方面。但是，对于石榴皮中多酚
13、类成分（含量为石榴皮干质量的10%20%）的制备工艺方面的研究极少。而且前期药效试验也已证明，石榴皮多酚含量与其生物活性呈明显的正相关性。为了合理利用这部分废弃资源，更好地开发、利用石榴皮中的多酚，笔者采用紫外-可见分光光度法，以没食子酸为标准品，对石榴皮中的多酚进行含量测定，正交试验优选石榴皮总多酚最佳的制备工艺进行研究，以期为与石榴皮相关的保健食品的研究及资源开发提供理论依据和检测手段。 2 材料与仪器2.1试剂与试药 没食子酸对照品中国药品生物制品检定所（批号：MUST1-13040103）石榴皮药材产自山东（20140302）、广东（20110901）、湖北（20131201）钨酸钠
14、天津市科密欧化学试剂有限公司（批号：20130110）钼酸钠天津市永大化学试剂有限公司（批号：20110615）磷酸天津市富宇精细化工有限公司（批号：20111130）盐酸广州化学试剂厂（批号：20140111）硫酸锂天津市福晨化学试剂厂（批号：20130317）30%过氧化氢广州化学试剂厂（批号：20140501-1）无水碳酸钠天津市诺克科技发展有限公司（批号：20130106）乙醇天津市富宇精细化工有限公司（批号：20080728）超纯水实验室自制2.2 主要仪器KQ3200DE型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司UV1102紫外可见分光光度计上海天美科学仪器有限公司AUY型电子天平岛
15、津（中国）有限公司CP225D型电子天平（分度值：0.01mg）德国Sartorius公司GZX-9246MBE电热恒温鼓风干燥箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂TC-15套式恒温器海宁市新华医疗器械厂WS70-1型红外快速干燥器巩义市予华仪器有限责任公司 DFY-300摇摆式高速万能粉碎机温岭市林大机械有限公司3 方法3.1 石榴皮总多酚含量测定方法3.1.1 总多酚含量的测定采用磷钼钨酸法16，以没食子酸为标准品。福林试剂(FC试剂)的配制：在1000mL的圆底烧瓶内加入50g钨酸钠、12.5g钼酸钠、350mL蒸馏水，85%的浓磷酸25mL及浓盐酸50mL，充分混匀，加热回流10h，再加入15g硫酸锂，15mL双氧水，然后开口继续煮沸15min，待双氧水完全挥发，呈亮黄色。冷却后定容至500mL，过滤，滤液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中，此液放置于冰箱中备用。3.1.2 标准品溶液的制备 取没食子酸标准品约7mg，精密称定，用蒸馏水溶解并定容至50mL，得浓度为0.1446 mgmL-1的对照品储备液。同法制备对照品储备液
